有經(jīng)驗(yàn)的科研伙伴們一定知道，在做反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，想要讓反轉(zhuǎn)錄順利進(jìn)行，并且得出好看漂亮的擴(kuò)增曲線，去除RNA中的雜質(zhì)是必不可少的一個(gè)步驟，今天小朗就來(lái)帶大家一起了解下關(guān)于反轉(zhuǎn)錄中雜質(zhì)的那些事兒......
反轉(zhuǎn)錄是什么
反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成DNA的過(guò)程，是對(duì)中心法則的重要修正和補(bǔ)充。
遺傳信息傳遞的中心法則
中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。
逆轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的本質(zhì)區(qū)別在于：反轉(zhuǎn)錄是人工合成DNA的過(guò)程，逆轉(zhuǎn)錄是RNA病毒自主形成DNA的過(guò)程。前者發(fā)生在體外，后者發(fā)生在體內(nèi)。所以我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)生的是反轉(zhuǎn)錄。
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的示意圖如下圖所示：
雜質(zhì)的種類和測(cè)定方法
想要知道RNA模板中是否存在雜質(zhì)以及雜質(zhì)的種類，可以利用Beer-Lambert定律通過(guò)測(cè)定其對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光吸收度而確定。
朗伯比爾定律(Lambert-Beer law)是分光光度法的基本定律，是描述物質(zhì)對(duì)某一波長(zhǎng)光吸收的強(qiáng)弱與吸光物質(zhì)的濃度及其液層厚度間的關(guān)系。
純的RNA A260/280在1.9-2.0之間，不同波長(zhǎng)的吸光度比值可以確定是否存在特定污染物（表1）。請(qǐng)注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波長(zhǎng)的紫外線。
波長(zhǎng) | 表明存在 | 目標(biāo)比值 |
230 nm | 有機(jī)化合物，糖，尿素，鹽 | A260/A230 > 1.8 |
260 nm | 所有核酸 | A260 ≈ 0.1–1.0 |
270 nm | 苯酚 | A260/ A270 > 1.0 |
280 nm | 蛋白質(zhì) | RNA: A260/A280 ≈ 2.0 |
330 nm | 光散射 | A330 = 0 |
表1
雜質(zhì)的影響和去除方法
以上我們通過(guò)不同波長(zhǎng)的吸光度比值來(lái)確定了有哪些雜質(zhì)存在于RNA模板中。那么這些雜質(zhì)中有哪些會(huì)對(duì)RNA提取影響比較大，又要怎樣去除呢，一起來(lái)看下吧～
RNA純化過(guò)程中會(huì)混入鹽、金屬離子、乙醇、苯酚、SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等，均是常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，會(huì)大大影響反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
去除方法：
可將已確定的高質(zhì)量RNA模板同樣品混合，同高質(zhì)量 RNA模板比較產(chǎn)量以檢測(cè)RNA抑制劑；若高質(zhì)量模板RNA與樣品混合后產(chǎn)量降低，則說(shuō)明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行清洗，以除去抑制劑。
多糖——抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性
多糖的污染是影響RNA提取質(zhì)量的重要因素之一，能抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性[1]；因多糖的許多理化性質(zhì)與RNA相似，所以在提取RNA的過(guò)程中很難將它與RNA分開(kāi)，去除多糖的同時(shí)RNA也會(huì)被除去，從而導(dǎo)致RNA產(chǎn)量減少。
去除方法：
目前，去除多糖的方法主要有醋酸鈉沉淀法、LiCl沉淀RNA法、高濃度Na+或K+沉淀RNA法、低濃度乙醇沉淀法等[2]。
蛋白質(zhì)也是污染RNA樣品的重要因素。由于多酚氧化酶和RNase均為蛋白質(zhì)，因此要獲得高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白質(zhì)。
去除方法：
常用RNA提取方法的CTAB法中的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）可有效地分離蛋白質(zhì)，加入的SDS(十二烷基硫酸鈉)能與蛋白質(zhì)螫合形成穩(wěn)定化合物而除去蛋白質(zhì)。常用RNA提取方法的Trizol法則是通過(guò)強(qiáng)蛋白變性劑異硫氰酸胍鹽和盧一巰基乙醇抑制RNase的活性。且在提取過(guò)程中，增加了氯仿抽提次數(shù)和使用水平衡酚進(jìn)行抽提，氯仿可使蛋白質(zhì)變性，有助于液相與有機(jī)相的分離，而水平衡酚能分離RNA，經(jīng)過(guò)多次的離心，使RNA存在水相中而被分離出來(lái)。
總之，RNA的提取方法有多種，根據(jù)原材料的不同而選擇，不可避免會(huì)有各種不同的雜質(zhì)存在，但提取過(guò)程中同時(shí)也會(huì)伴隨著RNA的降解現(xiàn)象發(fā)生。那么，污染和降解取得平衡，保證反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)順利進(jìn)行，擴(kuò)增出目的基因，才是我們最主要的實(shí)驗(yàn)任務(wù)。
