一根漂亮的擴(kuò)增曲線絕對(duì)是他們的心情曲線， 如果突然這根擴(kuò)增曲線翹尾了， 心情大概就是 小朗最近就收到這樣一名用戶的反饋， 她說在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)， 擴(kuò)增曲線翹尾了...... 她的擴(kuò)增曲線如下圖所示： 那么下面的內(nèi)容絕對(duì)值得你收藏! 擴(kuò)增曲線翹尾是指在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中有曲線出現(xiàn)末尾起跳但是沒有完整擴(kuò)增的現(xiàn)象，導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象出現(xiàn)的原因深究下來主要是2點(diǎn)： 1、目的基因濃度過低，CT值過高，導(dǎo)致曲線后移，這樣就會(huì)出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象； 2、在反應(yīng)體系中沒有加入模板DNA的情況下，外源污染的核酸進(jìn)入反應(yīng)體系也會(huì)出現(xiàn)翹尾。 如果是第一個(gè)原因， 那么給目的基因增加濃度即可。 彌散到實(shí)驗(yàn)室各個(gè)角落，比較棘手； 移液器、離心機(jī)、核酸提取儀、傳遞窗、PCR儀、拆開的試劑盒、槍頭盒、打開的耗材等表面。 以小編的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同來源的核酸污染帶來的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)不同（下圖數(shù)據(jù)僅供參考）。 嚴(yán)格的PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)的正負(fù)壓系統(tǒng)及四分區(qū)（或三分區(qū)）， 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室及PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)基本要求來建設(shè)。 可參考的標(biāo)準(zhǔn)為《GB50346-2011建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》 及衛(wèi)健委下發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》。 PCR實(shí)驗(yàn)室若不規(guī)范進(jìn)行分區(qū)，容易發(fā)生氣溶膠污染。 現(xiàn)有技術(shù)指導(dǎo)原則，要求選擇BSL-Ⅱ級(jí)生物安全柜。 從臨床經(jīng)驗(yàn)來看，只有B2型生物安全柜為全排放， 無循環(huán)風(fēng)，可以用于加核酸模板。不建議A1型、A2型和B1型， 因其循環(huán)風(fēng)很容易造成核酸氣溶膠的形成，且污染很難清除。 吸取陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒）沒有遵循“慢吸快打”的原則（這個(gè)需要練習(xí)形成“肌肉記憶”）。 新手往往是“快吸快打”，容易造成陽(yáng)性樣品污染槍頭， 或者在生物安全柜循環(huán)風(fēng)的影響下，造成氣溶膠飛濺，污染加樣區(qū)域。 應(yīng)使用帶有濾芯的槍頭。 且加完樣的槍頭要丟入含有次氯酸溶液的加蓋垃圾桶中 （因?yàn)榇温人崛菀讚]發(fā)，因此應(yīng)每天都要更換含氯消毒液?。?/p> 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》指出， 短片段的基因核酸對(duì)紫外線損傷不敏感。 常規(guī)消毒劑如酒精、碘化物、戊二醛類、季銨鹽等雖然能殺菌， 但是不能降解核酸，或降解效率較差。 次氯酸鹽類消毒劑可以一定程度降解核酸， 但是腐蝕性強(qiáng)，不能處理精密儀器及金屬制品， 容易腐蝕移液器吸桿影響tip頭氣密性。 紫外線照射12~18小時(shí)，但是注意，紫外線有效距離在80cm~100cm之間， 且對(duì)200bp以下的短片段核酸不敏感，容易留死角，所以還要同時(shí)加強(qiáng)通風(fēng)。 吸附在儀器設(shè)備等物體表面上的核酸污染處理：使用沒有腐蝕性的核酸清除劑。 例如使用酶解法（耐熱核酸降解酶）的清除劑， 處理移液器、生物安全柜、離心機(jī)、傳遞窗等區(qū)域進(jìn)行噴灑清除。 靜置15分鐘即可。 丟棄3個(gè)分區(qū)的所有用過的耗材（主要是tip吸頭和離心管、拆開的試劑盒等）、 非一次性實(shí)驗(yàn)服工作服應(yīng)用次氯酸鹽溶液浸泡1小時(shí)后，進(jìn)行洗滌處理； 盡量使用一次性生物安全Ⅱ級(jí)防護(hù)服或?qū)嶒?yàn)服。 標(biāo)本進(jìn)行核酸提取和檢測(cè)時(shí)應(yīng)盡可能在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。 如為打開標(biāo)本管蓋或其他有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作，則必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。 每天實(shí)驗(yàn)后，使用0.2%含氯消毒劑或75%酒精進(jìn)行臺(tái)面、地面清潔。 除了上面常規(guī)的消毒清潔之外，另外可采用專門的實(shí)驗(yàn)室污染去除儀去除實(shí)驗(yàn)室核酸污染。 樣品臺(tái)清潔： 用加液槍加取125ul 75％乙醇溶液或異丙醇至所有孔內(nèi)。使用加液槍對(duì)孔內(nèi)溶液進(jìn)行多次吹洗，移除孔內(nèi)的液體。 再用加液槍加取125ul核酸清除劑至所有孔內(nèi)。使用加液槍對(duì)孔內(nèi)溶液進(jìn)行多次吹洗，移除孔內(nèi)的液體。 使用純凈水進(jìn)行二次吹洗，移除孔內(nèi)的液體，設(shè)置運(yùn)行程序 93℃、5分鐘，熱蓋關(guān)閉，使96孔模塊內(nèi)水漬蒸干。 注：若遇見樣品臺(tái)孔內(nèi)異物頑固或較多情況，可先用酒精棉拿鑷子清理；再使用加液槍清洗。 儀器表面清潔： 應(yīng)使用0.2%含氯消毒劑或75%酒精進(jìn)行清潔。 污染，是PCR實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)假陽(yáng)性、結(jié)果不可信、數(shù)據(jù)不可靠的重要推手。 而且因?qū)嶒?yàn)室污染后難以清除，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室廢棄也是屢見不鮮的。 所以，在最初建立PCR實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候， 應(yīng)考慮最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)， 在實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)及日常實(shí)驗(yàn)室管理和操作中， 就需要進(jìn)行合理的規(guī)劃以及嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室SOP，把污染的可能性扼殺在搖籃中。
